细菌常以包裹在胞外聚合物(EPS)中的生物膜形式存在，使其能抵抗恶劣环境和抗菌治疗，导致严重感染(如囊性纤维化、癌症相关感染)并定植于植入物或软组织(如胆囊、肺)。鼠伤寒沙门氏菌(S. Typhimurium)是此类典型病原体，其生物膜可扩散至深部组织。
传统生物膜研究多在琼脂等平面基底上进行，揭示了基底刚度等因素对形态的影响。然而，这些模型无法模拟慢性感染中常见的、嵌入3D环境(如软组织)的生物膜特性及其增强的耐药性。早期将细菌封装在3D水凝胶(如海藻酸盐)中的研究显示出更高的生理相关性，但仍受限于营养/氧气梯度问题。
3D生物打印技术，特别是挤出式打印，为解决上述局限提供了潜力。它可精确制造复杂3D结构，模拟天然组织环境。基于藻酸盐和明胶等天然聚合物的生物墨水被广泛探索，但将其用于打印活菌(LM)或生物膜模型仍在发展中，对高细胞密度下生物墨水流变学特性及其如何影响3D环境中生物膜生长的理解尚不足。本研究利用挤出式生物打印，在类组织培养条件下构建3D鼠伤寒沙门氏菌生物膜模型。重点研究了，不同初始细菌浓度对两种分子量藻酸盐水凝胶前体流变特性和可打印性的影响。 聚合物分子量和初始细菌密度对细菌存活率、聚集体形成及形态的影响。结果表明，添加不同浓度的细菌对两种藻酸盐前体的流变特性无显著影响，均能实现高可打印性。该3D打印生物膜模型为研究病原菌在类软组织材料中的相互作用及未来高通量药物筛选提供了新平台。
二、材料和方法
采用SunP Biomaker V2进行基于挤出的3D生物打印。水凝胶被打印为10×10×1 mm的结构，该结构通过CAD软件预先设计，采用直线填充模式，填充密度为20%，层高达0.5 mm。 将无细胞水凝胶装入3 mL注射器中，在25°C条件下，使用22号锥形尖端针头(内径=0.41 mm)进行打印。为表征水凝胶的可打印性，将水凝胶样品逐层打印在1 mm厚的载玻片上，通过成像评估丝宽和孔径大小。研究了三种初始接种浓度的鼠伤寒沙门氏菌(1×105、106、107CFU/mL)用于打印载菌结构。将所需浓度的细菌离心pellet，重悬于50 μL 1×PBS中，加入3 mL水凝胶溶液，并用立体移液管反复抽吸混合。载菌水凝胶支架的打印速度为5 mm/s，挤出速率为0.6 mm3/s。生物打印结构用5%(w/v)CaCl₂溶液交联4分钟，用PBS溶液冲洗两次，然后在添加10% FBS的DMEM培养基中，于37°C、5% CO2条件下培养。随后对载菌结构进行为期4天的培养成像。
三、结果与讨论
3.1 水凝胶的流变学
本研究使用两种藻酸盐-明胶水凝胶，5%LA-5%Gel(含24 kDa低分子量藻酸盐)和1.5%MA-5%Gel(含773 kDa高分子量藻酸盐)。交联前(CaCl2交联前)，两者在25°C下表现出相似的起始流变特性(图2a)，但凝胶时间不同(储能模量与损耗模量交点分别在6分钟和12分钟)。两者均表现为粘弹性固体(G' > G'', 图2b)并具有剪切稀化行为(图2c)。然而，经5% CaCl2交联并在37°C下测试后，5%LA-5%Gel的储能模量(~4.74 kPa)显著高于1.5%MA-5%Gel(~2.73 kPa)，表明其网络交联更致密(图2d)。应力松弛测试(10%应变，图2e)显示1.5%MA-5%Gel保留的初始应力比例更高(~39% vs ~25%)，松弛过程更慢，回弹性更好。而5%LA-5%Gel松弛更快。这些流变学差异主要归因于藻酸盐分子量的不同，符合低分子量聚合物导致更快松弛的文献报道。
图1. 鼠伤寒沙门氏菌(S. Typhimurium)水凝胶制备与表征示意图。
图2. 未包埋细菌的水凝胶前驱体流变特性。
3.2 封装细菌浓度的影响
将不同浓度(1×105至1×1010 CFU/mL)的鼠伤寒沙门氏菌封装入两种藻酸盐-明胶水凝胶前体(5%LA-5%Gel和1.5%MA-5%Gel)中，并在25°C下评估细菌负载量对其粘弹性的影响。结果表明(图3)，细菌浓度≤ 1×107CFU/mL时，对两种水凝胶的模量(G'和G'')均无显著影响。然而，浓度达到1×1010 CFU/mL时，两种水凝胶的模量均显著下降。该极高浓度下的细菌浓缩物本身(S. Paste)表现出类似弹性固体的行为，其模量远高于纯水凝胶，表明其显著改变了水凝胶的微观结构。细菌浓度较低时，水凝胶的剪切稀化行为保持不变。但在高浓度(1×1010 CFU/mL)下，剪切稀化效应增强。纯细菌浓缩物的流变行为则与纯水凝胶相似，均表现出剪切稀化特性。
